Producția de mononucleotide de β-nicotinamidă (NMN) în Escherichia coli

Abstract

Diabetul este o boală cronică și progresivă, cu prevalență în continuă creștere, care crește presiunea financiară asupra sistemelor de sănătate din întreaga lume. Recent, rezistența la insulină, caracteristică diabetului zaharat tip 2, a fost vindecată la șoarecii tratați cu precursor NAD ⁺ β-nicotinamidă mononucleotidă (NMN) , fără a fi raportate efecte toxice. Cu toate acestea, NMN are un preț ridicat, sunt necesare metode de producție mai rentabile. Acest studiu propune o metodă biotehnologică de producere a NMN în Escherichia coli . Arătăm că expresia bicistronică a nicotinamidei recombinante a fosforibosil transferazei (Nampt) și a fosforibosil pirofosfatului (PRPP) sintaza în prezența nicotinamidei (NAM) și a lactozei poate fi o strategie de succes pentru producția eficientă de NMN rentabilă. Vectorii de expresie proteică care transportă gena NAMPT de la Haemophilus ducreyi și PRPP sintaza de la Bacillus amyloliquefaciens cu mutație L135I au fost transformați în Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Producția de NMN a atins un maxim de 15,42 mg per L de cultură bacteriană (sau 17,26 mg per gram de proteină) în aceste celule cultivate în mediu PYA8 suplimentat cu 0,1% NAM și 1% lactoză.

Introducere

Potrivit Federației Internaționale de Diabet, numărul de adulți cu diabet zaharat de tip 2 a fost de 425 milioane în 2017 și este de așteptat să ajungă la 649 de milioane până în 2045. Pe scară globală, 12% din bugetul sănătății (sau 727 miliarde de dolari) este cheltuit privind tratarea diabetului. Studii recente au legat rezistența la insulină, semnul distinctiv al diabetului de tip 2, la scăderea funcției mitocondriale și scăderea nivelului de NAD ⁺ , precum și a raportului NAD ⁺ / NADH, observate și la îmbătrânire. NAD ⁺ este prezent în toate organismele vii și este o coenzimă bine cunoscută în reacțiile de oxidare-reducere. Deacetilazele de proteine dependente de NAD ^+, cum ar fi SIRT1 și SIRT6, servesc ca senzori metabolici și reglează căile din aval, care în cele din urmă restabilește funcția mitocondrială și sensibilitatea la insulină. Această constatare extinde domeniul de cercetare a efectelor NAD ⁺ la alte boli degenerative asociate cu îmbătrânirea, precum: cardiovasculare, cancer, artrită, osteoporoză sau boli Alzheimer.

Mononucleotida β-nicotinamidă (NMN) este un intermediar în biosinteza NAD ⁺ produsă din nicotinamidă (NAM) și fosforibosil pirofosfat (PRPP) de nicotinamidă fosforibosil transferază enzimă (Nampt) (EC 2.4.2.12). Fiind bine tolerată, fără efecte secundare raportate în timpul administrării pe termen lung la șoareci și prevenind declinul fiziologic asociat vârstei, NMN s-a dovedit eficientă în tratarea diabetului de tip 2 indus de dieta bogată în grăsimi, prin inversarea disfuncției mitocondriale asociate cu îmbătrânirea și salvarea efectul declinului asociat vârstei în celulele stem neurale.

NAM este de obicei convertit în NMN de către enzimele implicate în căile de salvare NAD ⁺ , cum ar fi Nampt. Acțiunea acestei enzime constituie principala activitate anabolică NAD ⁺ în celulă. Reglarea metabolismului și biosintezei nucleotidelor de mamifere sau microorganisme se realizează de obicei prin consumul de PRPP. PRPP rezultă din riboza-5-fosfat atât prin ramurile oxidative cât și neoxidante ale căii fosfatului de pentoză.

În bacterii, NAM este cel mai adesea convertit în acid nicotinic (NA) de nicotinamidaza, care este integrat pe calea Preiss-Handler, acesta fiind și cazul Escherichia col . La mamifere, nu a fost raportată activitatea nicotinamidazei; În schimb, NAM este convertit în NMN de una dintre enzimele NM fosforibosil transferază. Deși majoritatea bacteriilor nu au fosforibosil transferază NAM, enzima este exprimată în Haemophilus ducreyi și Shewanella oneidensis .

Organisme simple și metabolice versatile, cum ar fi Escherichia coli , sunt adesea utilizate în biotehnologie pentru exprimarea controlată a proteinelor cu activitate enzimatică dorită. ADN-ul care codifică astfel de enzime este adesea introdus în bacterii de către vectori de expresie, cum ar fi sistemul pET de la Novagen. Vectorii pET sunt transformați în bacterii care exprimă ARN polimeraza T7, cum ar fi E. coli BL21 (DE3). Controlul expresiei enzimelor se realizează cu ajutorul promotorului lac , care activează expresia numai în prezența lactozei (metabolizată și ca sursă de carbon) sau a analogului său structural structural, Isopropyl-1-Thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) ( nu este metabolizat, cu concentrare constantă în timpul procesului de creștere). Deoarece metabolismul bacteriilor este versatil, variația sursei de carbon și concentrația substraturilor enzimatice suplimentate sunt factori cheie de luat în considerare într-un proces biotehnologic.

În scopul de a aborda problema actuală a prețului ridicat al NMN , în lucrările noastre anterioare am propus o metodă de purificare din celulele bacteriene. Pentru o optimizare suplimentară a procesului, deoarece am reușit să găsim o singură metodă de producție de drojdie publicată, acest studiu propune o metodă de producție biotehnologică NMN simplă și rentabilă în Escherichia coli .

Rezultate

Transformarea bacteriană

Alinierea multiplelor secvențe de aminoacizi generate pentru NadV putativ de la Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 și Nampt de la Mus musculus , arată o similaritate ridicată (Fig. S1), ceea ce face ca toate aceste enzime să fie candidate pentru un proces biotehnologic.

E transformat. celulele coli cu gene nadV (NAMPT) purtate de plasmide pET28a (+) au format colonii pe plăcile de Agar LB completate cu kanamicină. Nu s-au detectat colonii pe plăci inoculate cu celule bacteriene netransformate. Electroforeza cu gel de agaroză a ADN-ului plasmidic izolat din aceste colonii a confirmat prezența plasmidelor Nampt-PET28a, pET28a-soNadV sau pET28a-hdNadV în E. coli DH5α (Fig. suplimentară S2A, banda 2, 3, 4). Benzile ADN s-au potrivit cu benzile de la E. coli BL21 (DE3) celule pLysS (Fig. suplimentară S2A, banda 6, 7, 8), care au fost transformate cu plasmide corespunzătoare extrase direct din E. coli DH5α. În E netransformat. celule pLysS de coli BL21 (DE3), utilizate ca control negativ, prezența plasmidei pLysS a fost confirmată prin electroforeză, o bandă care se potrivește cu lungimea cunoscută de 4886 pb (Fig. suplimentară S2A, banda 5) a fost prezentată pe gel de agaroză.

(Pentru mai multe date experimentale, consultați site-ul web original: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)